COVID-19

ИНГИБИРОВАНИЕ ИНФЕКЦИЙ SARS-COV-2 В ИСКУССТВЕННЫХ ТКАНЯХ ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАСТВОРИМОГО АСЕ2

Патогенез COVID-19
Вспышки новых инфекционных заболеваний продолжают бросать вызов здоровью человека. По сообщениям, во многих частях мира растет число новых и вновь возникающих зоонозных заболеваний. Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV) впервые появился 17 лет назад (Drosten et al., 2003). В декабре 2019 года новый коронавирус (SARS-CoV-2) пересек видовые барьеры для заражения людей (Gorbalenya et al., 2020) и был эффективно передан от человека к человеку, что привело к вспышке пневмонии, впервые зарегистрированной в Ухане, Китай (Guan et al., 2020, Jiang et al., 2020, Чжоу и др., 2020b). Этот вирус вызывает коронавирусную болезнь-19 (COVID-19) с гриппоподобными симптомами, варьирующимися от легкой болезни до тяжелой травмы легких и полиорганной недостаточности, что в конечном итоге приводит к смерти, особенно у пожилых пациентов с другими сопутствующими заболеваниями. ВОЗ объявила пандемию COVID-19 .
SARS-CoV-2 имеет много общих черт с SARS-CoV (Andersen et al., 2020, Lu et al., 2020, Zhu et al., 2020). Филогенетический анализ SARS-CoV-2 показал, что этот вирус относится к линии В рода Betacoronavirus (Chan et al., 2020, Летко и др., 2020). Домен связывания рецепторов (RBD) SARS-CoV-2 аналогичен RBD SARS-CoV, что предполагает возможный общий рецептор клетки-хозяина. ACE2 был идентифицирован как функциональный рецептор SARS-CoV in vitro, а нашей  группой-in vivo (Imai et al., 2005, Куба и др., 2005). Чрезмерная экспрессия человеческого ACE2 усиливала тяжесть заболевания у мышей, инфицированных SARS-CoV, демонстрируя, что проникновение вируса, зависящего от ACE2, в клетки является пусковым механизмом инфекции (Yang et al., 2007). Мы сообщили, что инъекция SARS-CoV спайкового белка мышам снижала уровень экспрессии ACE2, тем самым усугубляя повреждение легких (Imai et al., 2005, Куба и др., 2005). Таким образом, ACE2 служит как входным рецептором SARS-CoV, так и для защиты легких от травм (Zhang et al., 2020b).
Три недавних исследования криоэлектронной микроскопии (cryo-EM) показали, что спайковый белок SARS-CoV-2 непосредственно связывается с ACE2, и спайковый белок SARS-CoV-2 распознает человеческий ACE2 с еще более высоким сродством связывания, чем Спайк из SARS-CoV (Walls et al., 2020, Wan et al., 2020, Wrapp et al., 2020). Недавно в клеточной культуре было продемонстрировано, что растворимый ACE2 связывается  Ig (Wrapp et al., 2020) или неспецифическим ингибитором протеазы под названием камостат мезилат (Hoffmann et al., 2020), что может ингибировать инфекции с псевдовирусом, несущим s-белок SARS-CoV-2. Было также показано, что высокие дозы (100 мкг/мл) мезилата камостата частично снижают рост SARS-CoV-2, как и ожидалось в предыдущих исследованиях с другими вирусами (Hoffmann et al., 2020).
В нормальном легком взрослого человека ACE2 экспрессируется преимущественно в клетках альвеолярного эпителия II типа, которые могут служить местом размножения вируса (Zhao et al., 2020). Эти клетки производят поверхностно-активное вещество, которое уменьшает поверхностное натяжение, тем самым предотвращая разрушение альвеол, и поэтому имеют решающее значение для газообменной функции легких (Dobbs, 1989). Повреждение этих клеток может объяснить тяжелое повреждение легких, наблюдаемое у пациентов COVID-19. Мы и другие также показали, что ACE2 экспрессируется во многих внелегочных тканях, включая сердце, почки, кровеносные сосуды и кишечник (Crackower et al., 2002, Danilczyk and Penninger, 2006, Ding et al., 2004, Gu et al., 2005, Hamming et al., 2004, Zhang et al., 2020b). Распределение ACE2 в этих тканях органах может объяснить мультиорганную дисфункцию, наблюдаемую у пациентов (Guan et al., 2020, Huang et al., 2020). Здесь мы сообщаем, что человеческий рекомбинантный растворимый ACE2 (hrsACE2), который уже был протестирован в фазе 1 и фазе 2 клинических испытаний (Haschke et al., 2013, Khan et al., 2017), может уменьшить вирусный рост в клетках Vero E6 в 1000-5000 раз. Кроме того, мы показываем, что органоиды кровеносных сосудов человека и органоиды почек могут быть легко инфицированы, что может быть значительно ингибировано hrsACE2 на ранней стадии инфекции.
Получение SARS-CoV-2
Для изучения потенциальных терапевтических вмешательств в отношении COVID-19 в начале февраля 2020 года мы выделили SARS-CoV-2 из носоглотки пациента в Швеции с подтвержденным COVID-19. После успешного культивирования на клетках Vero E6 выделенный вирус был секвенирован (GenBank: MT093571). Электронная микроскопия показала прототипную корональ-ную форму вирусных частиц нашего изолята SARS-CoV-2 (Рис.1 а).
hrsACE-2 может дозозависимо ингибировать инфекцию SARS-CoV-2
hrsACE2 уже прошел клиническую фазу 1 и фазу 2 тестирования (Khan et al., 2017) и рассматривается для лечения COVID-19 (Zhang et al., 2020b). Поскольку ACE2 является рецептором SARS-CoV-2, мы хотели предоставить прямые доказательства того, что hrsACE2 действительно может вмешиваться в инфекцию SARS-CoV-2. С этой целью мы инфицировали клетки Vero-E6 (клетки, используемые для выделения SARS-CoV-2) с различным количеством SARS-CoV-2: 103 бляшкообразующих единицы (PFUs; MOI 0.02), 105 PFUs (MOI 2) и 106 PFUs (MOI 20). Вирусная РНК как маркер репликации была очищена от клеток и проанализирована методом qRT-ПЦР (Рис.2 а). Инфицирование клеток в присутствии hrsACE2 в течение 1 ч с последующей промывкой и инкубацией без hrsACE2 значительно ингибировало ОРВИ-ков-2 инфекции Vero-E6 через 15 ч после заражения. Эти данные показывают, что hrsACE2 ингибирует прикрепление вируса к клеткам. Важно отметить, что, как и ожидалось от нейтрализующего агента, это ингибирование зависело от исходного количества вируса в инокуляте и дозы hrsACE2 (рис.2А), устанавливая дозозависимость. В отличие от hs rACE-2, эквивалентный мышиный рекомбинантный растворимый ACE2 (mrsACE2), продуцируемый тем же способом, что и hrsACE2, не ингибировал инфекцию .  Наконец, мы провели эксперименты, в которых клетки были инфицированы SARS-CoV-2 в присутствии hrsACE2 или mrsACE2 в течение 15 ч, чтобы захватить любые вновь произведенные вирусные частицы в течение 15 ч, которые могли бы заразить соседние клетки. Опять же, мы наблюдали значительное снижение вирусных инфекций в присутствии hrsACE2, но не mrsACE2. Следует отметить, что добавление человеческого или мышиного rsACE2 не было токсичным для клеток Vero-E6, контролируемых в течение 15 ч (данные не показаны). Эти данные показывают, что hrsACE2 значительно снижает уровень инфекции SARS-CoV-2 in vitro.
hrsACE-2 ингибирует инфекции SARS-CoV-2 человеческих капиллярных органоидов
Первичным очагом инфекции SARS-CoV-2, по-видимому, является легкое, которое может быть источником распространения вируса в другие ткани, такие как почки и кишечник, где был обнаружен вирус (табурет [Wang et al., 2020, Young et al., 2020] и мочи [Ling et al., 2020]).. Более того, виремия устанавливается во время течения заболевания, хотя вирусная РНК в крови наблюдается лишь изредка (Wang et al., 2020). Однако размер вируса составляет 80-100 Нм, что указывает на то, что виремический ОРВИ-ков-2 должен сначала заразить кровеносные сосуды до местных тканевых инфекций. Чтобы проверить эту гипотезу, мы установили человеческие капиллярные органоиды из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) (Рис. 3 А) и заразили их нашим изолятом SARS-CoV-2. Следует отметить, что эти органоиды очень напоминают человеческие капилляры с просветом, CD31+ эндотелиальной выстилкой, PDGFR+ перицитным покрытием, а также образованием базальной мембраны (Wimmer et al., 2019). Капиллярные органоиды анализировали методом qRT-ПЦР на наличие вирусной РНК на 3-е и 6-е сутки после первичного воздействия SARS-CoV-2. Важно отметить, что после заражения мы смогли обнаружить вирусную РНК в органоидах кровеносных сосудов с увеличением вирусной РНК с 3 - го по 6-й день после заражения, что указывает на активную репликацию SARS-CoV-2.
Супернатант инфицированных органоидов, собранный на 6-й день после заражения, мог эффективно инфицировать клетки Vero E6, показывая, что инфицированные капиллярные органоиды продуцируют вирусное потомство. Важно отметить, что добавление hrsACE2 заметно уменьшило инфицирование атипичной пневмонией искусственных кровеносных сосудов человека. Следует отметить, что добавление человеческого или мышиного rsACE2 не было токсичным для кровеносных сосудов человека, контролируемых в течение 3 дней (данные не показаны). Эти данные показывают, что человеческие капиллярные органоиды могут быть инфицированы SARS-CoV-2, и эта инфекция может быть значительно подавлена hrsACE2.

hrsACE-2 может ингибировать ОРВИ- CoV-2 инфекции органоидов почек человека
Мы и другие ранее показали, что ACE2 сильно экспрессируется в канальцах почек (Danilczyk and Penninger, 2006). Кроме того, было сообщено, что SARS-CoV-2 может быть обнаружен в моче (Ling et al., 2020). Чтобы проверить, может ли SARS-CoV-2 непосредственно инфицировать человеческие трубчатые клетки почек, мы создали органоиды почек из человеческих эмбриональных стволовых клеток в 3D-суспензионную культуру, адаптировав наш собственный протокол (Garreta et al., 2019). Важно отметить, что органоиды дифференцировки почек демонстрировали заметные трубчатые структуры, обнаруженные лектином Lotus tetraglobus (LTL) в качестве маркера проксимальных трубчатых эпителиальных клеток . Одноклеточное профилирование органоидов почек показало наличие клеток, экспрессирующих ACE2 в проксимальном канальце, и кластеров клеток podocyte II, экспрессирующих ключевые маркерные гены проксимальных канальцевых клеток (SLC3A1 и SLC27A2) и подоцитов (PODXL, NPHS1 и NPHS2) соответственно. Таким образом, органоиды почек содержат клеточные кластеры, которые экспрессируют ACE2 аналогично тому, что наблюдается в нативной ткани (Lin et al., 2020).
Инфекции органоидов почек контролировали через 6 дней после заражения SARS-CoV-2 и анализировали на наличие вирусной РНК с помощью qRT-ПЦР. Вирус потомства был определен, как и выше, с использованием повторного инфецирования клеток Vero E6. Как и ожидалось от клеток и тканей, экспрессирующих ACE2, SARS-CoV-2 реплицируется в органоидах почек . Супернатант инфицированных органоидов почек, собранный на 6-й день после заражения, может эффективно инфицировать клетки Vero E6, показывая, что сконструированные органоиды почек продуцируют вирус. Важно отметить, что добавление hrsACE2 значительно уменьшило ОРВИ-ков-2 инфекции органоидов почек человека в дозозависимом отношении. Следует отметить, что добавление человеческого или мышиного rsACE2 не было токсичным для почек, контролируемых в течение 3 дней (данные не показаны). Эти данные указывают на то, что помимо кровеносных сосудов, инженерные органоиды почек человека также могут быть инфицированы SARS-CoV-2, и эта инфекция может быть ингибирована hrsACE2.
Дизайн наших исследований был сосредоточен на ранних стадиях инфекции, демонстрируя, что hrsACE2 может блокировать раннее проникновение инфекций SARS-CoV-2 в клетки хозяина. Таким образом, мы не можем делать никаких прогнозов относительно влияния hrsACE2 на более поздние стадии заболевания. Во-вторых, мы не изучали органоиды легких, а легкие являются основным органом-мишенью для COVID-19. Для решения этих проблем необходимы дальнейшие исследования, чтобы пролить свет на влияние hrsACE2 на более поздних стадиях инфекции in vitro и in vivo.

Cell. 2020 Apr 17;S0092-8674(20)30399-8.

Inhibition of SARS-CoV-2 Infections in Engineered Human Tissues Using Clinical-Grade Soluble Human ACE2

Vanessa Monteil 1Hyesoo Kwon 2Patricia Prado 3, [el al].

DOI: 10.1016/j.cell.2020.04.004
Ссылка на полный текст:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7181998/